Sviluppo di nuovi veicoli non virali per strategie terapeutiche innovative nella medicina personalizzata delle malattie neuromuscolari

Introduzione della problematica nel contesto scientifico internazionale:

La distrofia muscolare di Duchenne (DMD) è la patologia ereditaria causata da mutazioni nel gene DMD che si traduce in una cascata di eventi che portano ad infiammazione cronica, degenerazione muscolare progressiva e sostituzione del muscolo con tessuto fibroadiposo  [Kinali et al. 2011]. Tra l'ampia gamma di mutazioni, la maggioranza comprende grandi delezioni intrageniche di uno o più esoni che interrompono il frame di lettura [Aartsma-rus et al. 2006 Le strategie terapeutiche più avanzate si basano sull’utilizzo di oligonucleotidi antisenso (AON) per l’exon-skipping [Marchesi et al. 2022] o  gene editing [Lattanzi et al. 2017] per il recupero della corretta espressione della proteina.

Rilevanza del problema:

La terapia genica è una strategia terapeutica principalmente utilizzata per prevenire o curare malattie genetiche. Le tecnologie di gene delivery e gene editing, basate rispettivamente su vettori virali e nucleasi specifiche, costituiscono una potenziale modalità terapeutica per riparare in modo permanente il gene DMD. La somministrazione diretta in vivo di veicoli virali ingegnerizzati presenta dei rischi che richiedendo lo sviluppo di sistemi innovativi che riducano al minimo la risposta immunitaria e aumentino la specificità tissutale.

Metodo attraverso il quale il problema verrà affrontato:

Gli esosomi sono nanoparticelle lipidiche che operano come trasportatori naturali di macromolecole come lipidi, proteine, acidi nucleici e microRNA mediante la fusione con la membrana delle cellule riceventi. Questo offre vantaggi unici poiché gli esosomi sono tessuto-specifici, non sono immunogenici, e permettono il trasferimento di molecole terapeutiche, proteggendole dagli enzimi di degradazione presenti a livello extracellulare.

Come la maggior parte delle scoperte in campo biologico, anche gli esosomi e la loro capacità di trasporto specifica verso target cellullari sono stati sfruttati a scopo terapeutico. La logica dietro la loro capacità terapeutica è che possono trasferire biomolecole del signaling e/o terapeutiche per indurre cambiamenti metabolici e fisiologici in cellule e tessuti malati. Il loro impiego è stato già testato per trasportare molecole naturali [Song H et al. 2021],RNA antisenso [Kase et al. 2021] e proteine [Yao et al. 2021] per fini terapeutici.

Un lavoro recente ha dimostrato per la prima volta che gli EXO derivati dal muscolo scheletrico incapsulano i myomiRs (microRNA specifici del muscolo scheletrico che giocano un ruolo significativo praticamente in ogni fase dello sviluppo del muscolo scheletrico, Horak et al. 2016), alcuni dei quali entrano nel sangue, mentre una parte viene utilizzata per la comunicazione locale tra i tessuti muscolari prossimali [Matejovič et al. 2021].

Per questi motivi riteniamo che gli esosomi possano essere utilizzati per trasportare agenti terapeutici (per exon-skipping o gene editing) per il trattamento di patologie come la DMD.

Il progetto si svilupperà in tre diverse fasi organizzate in Work Packages: WP1) purificazione e caratterizzazione degli esosomi da cellule muscolari e da latte bovino come controllo sperimentale, WP2) test di diverse metodiche di caricamento degli esosomi con RNA antisenso legati a fluorocromi (per quantificare con precisione l’efficienza di caricamento e la fusione degli esosomi caricati con le cellule target) o il complesso ribonucleoproteico CRISPR/Cas9 quantificando contestualmente l’efficacia del trattamento terapeutico, WP3) trattamento di topi distrofici con esosomi caricati con agenti terapeutici e valutazione funzionale e molecolare dell’efficacia del trattamento.

Le attività del WP3 saranno svolte all’estero presso l’azienda biotecnologica Genethon, esperta nello sviluppo di terapie geniche per le malattia genetiche. Gli studi in vivo saranno svolti presso il laboratorio francese per un periodo di 10 mesi durante i quali verranno sviluppate competenze specifiche sul trattamento terapeutico delle malattie neuromuscolari e riguardo l’analisi di biodistribuzione degli esosomi caricati nei tessuti murini.

Inoltre, durante i 10 mesi a Genethon verranno approfondite le conoscenze e competenze relative ai processi regolatori e protocolli richiesti per presentare un nuovo trattamento terapeutico alle principali agenzie del farmaco come l’Agenzia Europea per i Medicinali (EMA).

Obiettivi:

Questo progetto intende valutare la possibilità di caricamento degli esosomi con molecole terapeutiche e il loro targeting specifico di cellule muscolari per il trattamento della Distrofia Muscolare di Duchenne.

Risultati attesi:

Prevediamo di identificare la metodica migliore per massimizzare il caricamento degli esosomi con gli agenti terapeutici. L’efficienza di trasporto e l’efficacia del trattamento terapeutico saranno valutati inizialmente in modelli cellulari e successivamente in vivo.  L’iniezione intravenosa in un modello murino di distrofia muscolare permetterà agli esosomi di raggiungere il tessuto muscolare e fondersi con le cellule muscolari ripristinando l’espressione della distrofina e il recupero della corretta architettura e funzionalità muscolare.

Bibliografia:

Aránega AE, Lozano-Velasco E, Rodriguez-Outeiriño L,
Ramírez de Acuña F, Franco D, Hernández-Torres F. MiRNA e rigenerazione
muscolare: bersagli terapeutici nella distrofia muscolare di Duchenne. Int J
Mol Sci. 2021;22(8):4236. Pubblicato 2021 Apr 19.
DOI:10.3390/ijms22084236

Genethon,1 Rue de l'Internationale BP 60 Evry-Courcouronnes, 91000 France

Periodo: 10 mesi

Il progetto è coerente con i seguenti Ambiti di Ricerca e Innovazione del PNR 2021-2027:

5.1 Salute
5.1.3 Biotecnologie:
articolazione 6: Terapia genica e medicina personalizzata
5.1.4 Tecnologie per la salute:
articolazione 9: Nanotecnologie per la nanomedicina

Il progetto di ricerca proposto mira alla generazione di nuove strategie per veicolare agenti terapeutici ad RNA sfruttando gli esosomi, vescicole lipidiche naturalmente prodotte dalle cellule umane. L’applicazione dei risultati di questo progetto permetterà di migliorare le attuali strategie terapeutiche e aumentare la specificità di delivery. In questo modo, si potranno ridurre gli effetti collaterali dovuti alla bassa specificità degli attuali metodi di delivery e sviluppare terapie geniche innovative e personalizzate.

• Distrofia muscolare
• Esosomi
• Gene delivery
• Gene editing
• RNA therapy
• Terapia genica personalizzata