Ricerca e sperimentazione di nuovi organismi probiotici per contrastare agenti patogeni nell’allevamento delle larve di ostriche (ostrea edulis) e vongole (ruditapes philippinarum) e in fase di depurazione.

La molluschicoltura rappresenta la principale voce produttiva per l’acquacoltura italiana, con una produzione basata soprattutto su mitili (Mytilus galloprovincialis) e vongole veraci (Ruditapes Philippinarum), tanto da risultare come primo paese produttore di questa specie all’interno dell’Unione Europea (9) e secondo solo alla Cina a livello globale (11). Di minore entità numerica ed economica risulta essere l’allevamento dell’ostrica europea (Ostrea edulis), ma la sua importanza non va trascurata. La produzione di questa specie, infatti, risulta essere scarsa su tutte le coste europee, ed in particolar modo su quelle del Mar Mediterraneo (3; 4), nonostante la domanda di mercato continui ad essere elevata, anche dopo l’introduzione della specie alloctona Crassostrea gigas, più resistente e dalla crescita più rapida (1). Oltre a rappresentare una risorsa economica fondamentale, questo settore ha acquisito negli anni un importantissimo valore storico e culturale, soprattutto per quanto riguarda le zone costiere della nostra penisola e le persone che le abitano, grazie alle quali queste risorse vengono ora considerate prodotti d’eccellenza in tutto il mondo.

Nonostante negli ultimi vent’anni quello dell’acquacoltura sia risultato il più fiorente tra i settori alimentari, la crescita non è stata omogena in tutti i paesi del mondo. Nell’ultimo decennio, infatti, l’acquacoltura italiana (così come quella europea in generale) non ha espresso grandi potenzialità di crescita ed innovazione (9). Indubbiamente negli ultimi due anni il calo del rendimento è attribuibile anche alla pandemia di COVID-19, ma guardando più indietro, una delle problematiche a cui è riconducibile questa situazione di stallo è l’insorgenza di patologie dovute all’infezione da microorganismi, soprattutto batteri. Per quanto riguarda i bivalvi, le pricipali patologie che li vedono coinvolti sono le vibriosi (infezioni a carico di batteri del genere Vibrio), che si traducono in un alto tasso di mortalità principalmente negli schiuditoi, dove vengono allevate larve e post-larve (7; 10).

Per cercare di arginare il problema sono state testate diverse soluzioni: generalmente si ricorre all’utilizzo di terapie antibiotiche o di disinfezione, che tuttavia comportano diversi svantaggi (2; 6; 8), tra cui possibile tossicità per l’animale, rilascio di residui chimici nell’ambiente e soprattutto possono portare ad una selezione di ceppi patogeni resistenti ai rimedi utilizzati (Prado et al., 2009) con la capacità di renderne resistenti anche altri, precedentemente vulnerabili a tali soluzioni. L’esigenza di trovare una soluzione che combatta efficacemente questi patogeni, non produca effetti secondari negativi a lungo termine e, ad oggi, permetta di proporre un’alternativa più ecosostenibile ed economicamente conveniente per gli allevatori, sembra avere trovato nei cosiddetti agenti probiotici l’approccio più promettente (12). Secondo la FAO, può essere considerato probiotico “un microorganismo vivo che, quando somministrato in quantità adeguate, può conferire benefici allo stato di salute dell’ospite”. Nei vivai di allevamento dei bivalvi questa metodologia potrebbe risultare particolarmente adatta. Le larve di questi animali, infatti, vengono in contatto con altri organismi microbici sin dai primi stadi dello sviluppo (soprattutto per quanto riguarda le ostriche). Inoltre, il meccanismo di filtrazione continua utilizzato per nutrirsi, incrementa l’influenza del mezzo in cui sono immersi (l’acqua degli schiuditoi) (Prado et al., 2009) e, di conseguenza, dei microorganismi che vi sono contenuti. Già diversi studi hanno individuato ceppi batterici che rispondono positivamente all’interazione con microorganismi patogeni, ma la grande diversità del mondo microbico, e la facilità con la quale gli organismi che vi appartengono modificano le proprie caratteristiche genetiche e fisiologiche, rendono necessaria una continua ricerca, con lo scopo di individuare nuove specie efficaci.

Obiettivo del progetto

Considerato che l’acquacoltura è il settore produttore di proteine animali in più rapida crescita nel mondo (5) è necessaria una continua ricerca sul controllo delle patologie dovute a microorganismi che colpiscono gli animali allevati. Lo scopo del progetto è quindi individuare e testare l’efficacia di nuovi organismi probiotici contro patogeni che colpiscono l’ostrica europea (O. edulis) e la vongola filippina (R. philippinarum), allevate negli stabilimenti della zona della sacca di Goro, in grado di fornire una valida e conveniente alternativa ai metodi tradizionali e, contemporaneamente consentire di implementare la crescita e la resilienza delle aziende del settore. Le analisi vengono effettuate principalmente sulle larve di queste due specie, grazie al supporto della ditta Naturedulis Srl di Goro, che si occupa della riproduzione delle principali specie di molluschi bivalvi di interesse commerciale, e con la quale ci sono già state altre collaborazioni nell’ambito di altri progetti sui bivalvi (e.g. Scope For Growth di O. edulis). Nonostante esistano già diversi studi sull’argomento, questo tipo di metodologia può ancora essere considerata un metodo innovativo nel settore dell’acquacoltura, considerato il fatto che l’impiego di sostanze come gli antibiotici è tuttora molto più diffuso. In aggiunta, la sperimentazione dei probiotici viene eseguita anche in fase di depurazione del prodotto, quindi su organismi adulti, pronti per la distribuzione. In questa fase l’obiettivo è osservare l’efficacia di questi rimedi (in alternativa ai metodi utilizzati di consueto come UV o ozono) anche su quei microrganismi che solitamente sono dannosi per il consumatore.

Materiali e metodi

Isolamento di potenziali organismi probiotici

La metodologia utilizzata prevede innanzitutto l’isolamento e l’identificazione dei ceppi batterici patogeni da esemplari malati. I batteri identificati verranno successivamente utilizzati come organismi target per testare l’efficacia dei probiotici. Si prosegue con l’isolamento di potenziali organismi probiotici, ottenuti dall’ambiente in cui vengono mantenuti solitamente i bivalvi allevati: acqua, substrato, pareti delle vasche in cui sono contenuti. È possibile provare a ottenere alcuni probiotici anche isolandoli da animali sani. Dopo averli isolati, si procede con un test in vitro per definire quali agiscano effettivamente come probiotici contro i patogeni target. Una volta identificati vengono tenuti separati dagli altri, in colture pure. Dei microorganismi probiotici viene eseguita un’estrazione ed una amplificazione del DNA, tramite PCR. Successivamente, il riconoscimento a livello di specie avviene con sequenziamento e confronto del risultato tramite ricerca all’interno di librerie genomiche online (NCBI). Nel caso non si disponesse della strumentazione necessaria alle analisi genetiche per il riconoscimento, questo verrà eseguito da aziende specializzate alle quali i campioni verranno inviati.

Sperimentazione in vivo

In condizioni ambientali stabili (temperatura, salinità, pH) l’efficacia dei probiotici viene osservata nelle vasche dello schiuditoio di Naturedulis, dove sono contenute larve di ostriche e vongole nelle quali è stata registrata la presenza di patogeni. La sperimentazione avviene tramite l’utilizzo di quattro gruppi di larve contemporaneamente:

1. Gruppo di controllo, caratterizzato da soli animali sani;
2. Gruppo caratterizzato da sole larve in cui è presente l’agente patogeno;
3. Gruppo caratterizzato da larve in cui sono presenti patogeni, al quale vengono aggiunti i microrganismi probiotici; 
4. Gruppo nel quale le larve sane vengono esposte alla sola presenza di organismi probiotici, per osservare una eventuale patogenicità anche di questi ultimi sugli animali analizzati.

Per ogni gruppo, la conta degli esemplari pre- e post-somministrazione dei probiotici può essere eseguita tramite conta manuale al microscopio, oppure grazie ad una lettura utilizzando uno spettrofotometro.

Sperimentazione in depurazione

Durante questa fase è previsto l’utilizzo dei probiotici in alternativa ai metodi utilizzati di consueto: UV e ozono. Per testare l’effettiva efficacia dei probiotici sui patogeni, inizialmente si procede con la sperimentazione in un sistema statico, privo di acqua corrente, costituito da vasche nelle quali vengono tenuti gli organismi (adulti) ai quali vengono somministrate dosi di agente probiotico. Una volta confermata l’efficacia, si osserva la risposta in un sistema “a castello” (solitamente usato per la depurazione), costituito da contenitori impilati uno sopra l’altro contenenti gli animali adulti, sui quali scorre un flusso continuo verticale di acqua arricchita con probiotici.

Risultati attesi

Quello dei probiotici è un argomento ampiamente trattato negli ultimi anni, con studi che mostrano spesso risultati incoraggianti. Nell’ambito dell’acquacoltura però, i risultati ottenuti dagli studi in laboratorio spesso non trovano un riscontro nel momento in cui la tecnica studiata è applicata negli allevamenti. Il principale motivo che porta a questa discrepanza è che i dati ottenuti derivano da una sperimentazione eseguita principalmente in vitro, e solo in minima parte (o per niente) in vivo. In questo studio l’analisi in vitro riguarda soltanto l’identificazione dei ceppi potenzialmente probiotici, mentre la sperimentazione vera e propria viene eseguita totalmente nello schiuditoio di Naturedulis, su larve mantenute in quelle che sono le condizioni e i parametri classici di allevamento. Tramite questa metodologia, al termine della sperimentazione si tenterà di ottenere una mortalità massima delle larve (in cui sono presenti patogeni) non più elevata del 25-30%. Per quanto riguarda la fase di depurazione, i livelli di patogeni finali attesi coincidono con quelli fissati dal ministero della salute (<230 mpn per 100g di mollusco e liquido intravalvare), per essere certi di garantire una corretta disinfezione al pari dei tradizionali metodi (UV e ozono).

L’effettivo ottenimento di risultati simili è perfettamente coerente con l’ambito e le finalità del piano REACT-EU e rappresenterebbe uno strumento utile a “promuovere il superamento degli effetti della crisi nel contesto della pandemia di COVID-19 e delle sue conseguenze sociali oltre a preparare una ripresa verde e resiliente dell’economia”. Il successo dell’impiego di agenti probiotici rappresenta infatti un’alternativa innovativa e sostenibile a livello industriale (come previsto dallo SNSI, Strategia Nazionale di Specializzazione Intelligente) rispetto ai classici metodi utilizzati, sia a breve che a lungo termine. Inoltre, considerata la situazione economica post pandemia, la transizione a metodologie che prevedono l’utilizzo di organismi probiotici rappresentano un notevole vantaggio, in grado di ridurre i costi e generare il bisogno di nuovi specialisti, facilitando la ripresa di questo settore che, in Italia, si trova da troppo tempo in una situazione di scarsa crescita.

Bibliografia
1. Agius, C., Jaccarini, V., & Ritz, D. A. (1978). Growth trials of Crassostrea gigas and Ostrea edulis in
inshore waters of Malta (Central Mediterranean). Aquaculture, 15(3), 195-218.
2. Akinbowale, O. L., Peng, H., & Barton, M. D. (2006). Antimicrobial resistance in bacteria isolated
from aquaculture sources in Australia. Journal of applied microbiology, 100(5), 1103-1113.
3. Barnabe, G., Doumenge, F., & de Monaco, M. O. (2001). Mariculture of Mediterranean species.
4. Basurco, B., & Lovatelli, A. (2003). The aquaculture situation in the Mediterranean Sea predictions
for the future.
5. Bostock, J., McAndrew, B., Richards, R., Jauncey, K., Telfer, T., Lorenzen, K., ... & Corner, R.
(2010). Aquaculture: global status and trends. Philosophical Transactions of the Royal Society B:
Biological Sciences, 365(1554), 2897-2912.
6. Diaz-Granados, C. A., Cardo, D. M., & McGowan Jr, J. E. (2008). Antimicrobial resistance:
international control strategies, with a focus on limited-resource settings. International journal of
antimicrobial agents, 32(1), 1-9.
7. Elston, R., Gee, A., & Herwing, R. P. (2000). Bacterial pathogens and their control in bivalve spat
culture. National Shellfisheries Association, Seattle, Wash.
8. Kemper, N. (2008). Veterinary antibiotics in the aquatic and terrestrial environment. Ecological
indicators, 8(1), 1-13.
9. Ministero delle politiche Agricole alimentari e forestali. Piano strategico per L’acquacoltura in Italia
2014-2020.
10. Nicolas, J. L., Comps, M., & Cochennec, N. (1992). Herpes-like virus infecting Pacific oyster
larvae. Bull. Eur. Ass. Fish Pathol, 12(1), 11.
11. Turolla, E. (2008). La venericoltura in Italia. Estado actual del cultivo y manejo de moluscos bivalvos
y su proyección futura, 177.
12. Vine, N. G., Leukes, W. D., & Kaiser, H. (2006). Probiotics in marine larviculture. FEMS microbiology
reviews, 30(3), 404-427.

Naturedulis S.r.l. - Piazzale Leo Scarpa, 45 - Goro

Il progetto è coerente con i seguenti Ambiti di Ricerca e Innovazione del PNR 2021-2027:

5.6.1 Green technologies
Articolazione: Sicurezza igienico-sanitaria degli alimenti

Il raggiungimento degli obiettivi del progetto rappresenta un’alternativa innovativa e, soprattutto, sostenibile rispetto ai metodi solitamente usati in acquacoltura. La transizione verso metodologie che prevedono l’utilizzo di probiotici, inoltre, si traduce in una riduzione dei costi e nell’opportunità di inserire all’interno delle aziende nuove figure specializzate, favorendo così la ripresa e la crescita di questo settore.

• Acquacoltura
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