CI TECNOLOGIE MOLECOLARI E RICOMBINANTI
Anno accademico e docente
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- English course description
- Anno accademico
- 2016/2017
- Docente
- GIOVANNI BERNACCHIA
- Crediti formativi
- 12
- Percorso
- BIOTECNOLOGIE PER L'AMBIENTE
- Periodo didattico
- Annuale
Obiettivi formativi
- L’acquisizione delle conoscenze delle tecniche e metodologie di base e dei loro ulteriori sviluppi applicativi per lo studio ed analisi degli acidi nucleici e dell’espressione genica, con particolare riferimento alle tecnologie impiegate per la produzione di DNA ricombinante
Modulo di Tecnologie Molecolari e Ricombinanti.
In questo ambito saranno trattate le applicazioni del DNA ricombinante in terapia genica.
Le esercitazioni daranno la possibilità allo studente di concretizzare le conoscenze teoriche acquisite e verteranno su alcune tra le metodiche più utilizzate (estrazione di RNA, retro-trascrizione di RNA in cDNA, PCR quantitativa) nei comuni laboratori di ricerca e contestualmente apprendere l’utilizzo di strumentazioni. In particolare, gli studenti impareranno ad usare le pipette (p1000, p200, p20) quali strumento di laboratorio, ed affronteranno i diversi step sperimentali volti all'analisi dell'espressione di un gene specifico, attraverso le tecniche di estrazione dell'RNA, la sua quantifcazione, sia mediante spettrofotometro che utilizzando lo strumento DeNovix; l'analisi qualitativa dell'RNA mediante elettroforesi su gel d'agarosio; la produzione di cDNA mediante retro-trascrizione ed, infine, la quantificazione di uno specifico trascritto di mRNA per PCR quantitativa.
CONOSCENZA E COMPRENSIONE
Lo studente apprenderà:
- la corretta terminologia scientifica
- le tecniche di base per l'estrazione di acidi nucleici
- le tecniche di base per il sequenziamento degli acidi nucleici, ma anche le basi del next generation sequencig e le sue possibili estensioni applicative
- le differenze tra i diversi tipi di vettori ricombinanti
CAPACITA' DI APPLICARE CONOSCENZA E COMPRENSIONE
Lo studente saprà:
- quale metodo utilizzare per estrarre il DNA, l'RNA e per la sua analisi.
- quali tecniche sono impiegate nelle analisi di genomica e trascrittomica.
- che tecnica deve utilizzare per le applicazioni specifiche, come produzione di una libreria di DNA o cDNA
- quali vettori usare per produrre una proteina
- quali vettori usare per modificare l'espressione genica (accenni anche alla modulazione dell'espressione mediante microRNA)
- quali vettori ricombinati usare e le conoscenze di base per le loro applicazioni in terapia genica e produrre un organismo transgenico.
Modulo Biologia Molecolare Vegetale.
Il modulo intende fornire conoscenze di base e specifiche riguardanti i meccanismi molecolari che regolano il funzionamento degli organismi vegetali, con particolare attenzione ai fenomeni unici nelle piante. Queste conoscenze vengono descritte con un occhio alle possibili modificazioni e applicazioni in campo agricolo e industriale.
Conoscenze
Lo studente apprenderà:
La struttura del genoma nelle piante (differenze in termini di dimensioni, composizione e struttura del genoma tra monocotiledoni e dicotiledoni)
Il funzionamento e la regolazione dell’espressione dei geni nelle piante (promotori e terminatori, geni marker e reporter)
I metodi noti di modificazione genetica delle piante (Agrobacterium tumefaciens e metodi diretti)
Alcune delle applicazioni delle piante transgeniche e i problemi correlati
I meccanismi di risposta delle piante superiori a tipi diversi di stress (biotici o abiotici) e il possibile miglioramento
I meccanismi di silenziamento genico nei vegetali
Le basi del miglioramento genetico delle piante e breeding molecolare
Abilità
Lo studente saprà:
Utilizzare la terminologia specifica della biologia molecolare vegetale
Comprendere e manipolare la struttura modulare del gene vegetale
Scegliere strategie sperimentali di studio applicate alla piante di interesse agricolo
Valutare con spirito critico i risultati di lavoro. Prerequisiti
- Modulo Tecnologie Molecolari e Ricombinanti: Conoscenze di base di Chimica, Biologia, Biochimica e Biologia Molecolare.
Modulo Biologia Molecolare Vegetale: Conoscenze di fisiologia vegetale e biologia molecolare, Contenuti del corso
- Modulo di Tecnologie Molecolari e Ricombinanti.
Gli argomenti trattati nelle lezioni in aula sono suddivisi in due aree tematiche: metodologie per l’analisi degli acidi nucleici e la loro espressione e/o modulazione (prima parte) e Tecniche di manipolazione del DNA, vettori di clonaggio, metodologie di trasfezione, ed esempi di applicazioni in Biotecnologia (seconda parte).
PRIMA PARTE: Metodologie per l’analisi degli acidi nucleici e la loro espressione e/o modulazione
Isolamento e purificazione di DNA, quantificazione ed analisi: elettroforesi in gel d’agaroso e poliacilamide, elettroforesi capillare (2 ore).
Tecniche di studio del genoma: impiego di enzimi (enzimi di restrizione, polimerasi, etc.), southern blotting, Reazione di Polimerizzazione a Catena (PCR), SNP-array, sequenziamento genico e Next Generation Sequencing (8 ore).
Isolamento e purificazione di RNA e introduzione ai microRNA; reazione di retro-trascrizione, PCR quantitativa e digital PCR e gene expression array (7 ore)
Tecniche applicate ad analisi su singola cellula: FACS, cDNA-PCR e utilizzio di array-tecnologie come RNA-sequencing, GCH array, Chip- and methyl-sequencing (5 ore)
SECONDA PARTE: Tecniche di manipolazione del DNA, vettori di clonaggio, metodologie di trasfezione, ed esempi di applicazioni in Biotecnologia.
Estrazione di DNA plasmidico, uso di enzimi per modificare il DNA e principi basilari per l’applicazione di tecniche di clonaggio (2 ore)
Tipi di vettori utilizzati nel clonaggio e loro applicazioni; librerie geniche (4 ore)
Array per lo studio dell’espressione genica e saggi di modulazione dell’espressione genica: impiego di RNA interference e gene silencing (4 ore)
Clonaggio di oligonucleotidi in vettori per lo studio delle interazioni microRNA/RNA (2 ore)
Trasfezione e tecniche impiegate per l’introduzione nelle cellule di vettori ricombinanti (2 ore)
Oligonucleotide-directed mutagenesis in vettori d’espressione (1 ore)
Vettori per terapia genica, Genome Editing, CRISPR-Cas system, e sistemi batterici di Restriction Modification (2 ore)
Clonazione (1 ora)
Modulo Biologia Molecolare Vegetale.
Le lezioni teoriche sono strutturate per argomenti a complessità crescente, della durata normalmente di circa 2 ore l’una.
Colture in vitro e micropropagazione vegetale, ruolo degli ormoni e applicazioni -- Il gene vegetale, ruolo del promotore e del terminatore, modularità strutturali -- Metodi di trasformazione genetica dei vegetali, Agrobacterium tumefaciens e metodi diretti, vettori di trasformazione genetica, protocolli di lavoro – Applicazioni e problematiche associate all’ottenimento e alla crescita di varietà transgeniche – Metodi di regolazione dell’espressione genica, RNA antisenso e interference, esempi applicativi – Organizzazione, struttura e caratteristiche dei genomi vegetali, dimensioni, elementi ripetuti e variabilita’ – Mappe genetiche e mappe fisiche, arricchimento in marcatori molecolari e tecniche di biologia molecolare per l’identificazione di nuovi marcatori – Miglioramento di specie vegetali di interesse agronomico, metodi classici e molecolari di incrocio e selezione – Risposte delle piante agli stress e resistenza ai patogeni, applicazioni di nuova generazione. Metodi didattici
- Gli argomenti del corso saranno affrontati in modo approfondito nelle lezioni in aula, dove peraltro saranno presentati anche riferimenti su riviste scientifiche, siti web trattanti i vari argomenti e video esplicativi. Gli argomenti trattati saranno spiegati attraverso presentazione powerpoint, che verranno di volta in volta fornite dal docente agli studenti. Nei testi consigliati non sono trattati tutti gli argomenti del corso e sono quindi suggeriti per una piu’ semplice comprensione dei concetti di base, risulta pertanto consigliata la partecipazione alle lezioni.
Modalità di verifica dell'apprendimento
- Esame orale, che avrà luogo sia alla fine del corso che durante le altre sessioni.
La prova d’esame ha lo scopo di verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti trattati nel corso e la capacità di ragionamento sviluppata dallo studente.
La prova orale consiste in un colloquio con una durata generalmente non inferiore a 30 minuti.
La valutazione è espressa in trentesimi e il voto minimo è 18. L’esame è superato se lo studente dimostra una conoscenza sufficientemente approfondita per ogni domanda posta e capacità di ragionamento.
La votazione tiene conto dell'insieme delle risposte date e della capacità di applicazione delle tecniche descritte nel corso. Il voto finale del C.I. Tecnologie Molecolari e Ricombinanti deriva dalla media dei voti conseguiti nei due moduli.
Modulo di Tecnologie Molecolari e Ricombinanti.
Come prima domanda viene chiesto un argomento a scelta dello studente. Durante l’esame saranno sottoposte una ulteriore serie di domande su argomenti di entrambe le parti del corso, le domande su ciascun argomento tenderanno a verificare progressivamente il grado di approfondimento raggiunto dallo studente.
L’esame non è superato se lo studente non riesce a rispondere nulla sulla domanda generale relativa anche solo ad uno degli argomenti trattati, o se nel corso dell'intero esame lo studente si limita a esporre pochi enunciati senza dimostrare una loro adeguata comprensione.
Modulo di Biologia Molecolare Vegetale.
Lo studente risponderà in media a tre domande generali, a cui seguono ulteriori domande di approfondimento che potranno spaziare ad altri argomenti del corso. Viene soprattutto valutata la capacità di porre in relazione i diversi temi del corso e la capacità di descrivere con spirito critico le conoscenze. Testi di riferimento
- Modulo di Tecnologie Molecolari e Ricombinanti.
-Biotecnologie Molecolari. Principi e tecniche. Prima edizione italiana condotta sulla quinta edizione inglese. Terry A. Brown - ZANICHELLI
-Ingegneria genetica. Principi e Tecniche. S. Primrose et al. - ZANICHELLI
-DNA ricombinante J.D. Watson et al. - ZANICHELLI
-Dai geni ai Genomi. Dale, von Schantz - EdiSES
-Analisi dei geni ai Genomi. Richerd J. Reece - EdiSES
-Materiale fornito dal docente
Modulo Biologia Molecolare Vegetale.
Articoli e review aggiornati tratti da riviste internazionali. Appunti e materiale didattico utilizzato durante le lezioni.
Buchanan B., Gruissem W., Jones R. Biochimica e Biologia Molecolare delle Piante. Ed. Zanichelli
